糖蛋白占人类蛋白质的50%以上，是大多数生物制药的关键组件。作为最广泛且复杂的翻译后修饰（PTM）之一，糖蛋白的糖基化对调节生物过程起着至关重要的作用。对糖蛋白一级序列的全面分析，包括糖基化位点的识别及相关聚糖结构，是理解其功能的关键步骤。

液相色谱-质谱法（LCMS/MS）近年来成为蛋白质鉴定和翻译后修饰发现的强大工具。不同于传统的数据库搜索策略，这里提出的从头测序方法不需要预先了解DNA或氨基酸序列。然而，由于多糖基化位点的复杂性，往往会导致序列覆盖不完整和游离寡糖修饰谱不明确，这使得获取信息丰富的糖肽碎裂谱以支持从头测序变得困难。因此，糖基化的广泛性常常使某些区域出现数据空白，这限制了从头测序在具有一致结构且已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）上的应用。

在2025年发表的研究中，题为“Decoding Protein Glycosylation by an Integrative Mass Spectrometry-Based De Novo Sequencing Strategy”，提出了一种结合糖基释放介导的从头测序与糖基化位点表征的新方法。该研究利用N-/O-糖的去糖基化实现了全面的序列覆盖，通过EThcD片段化技术，识别高质量的长肽，从而促进精确的蛋白质组装。

该方法进一步应用于复杂糖基化的融合蛋白依那西普（Enbrel）及三种未解序列的新型肿瘤坏死因子受体：Fc融合生物制剂的从头测序，揭示了一级序列之间的细微差异。此外，研究对这些蛋白质的N和O糖基化修饰进行了全面表征，填补了从头测序和糖基化修饰之间的空白，提供了关于糖蛋白一级结构和糖基化修饰的丰富信息。

研究方法包括：使用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，内切α-N-乙酰半乳糖胺酶（EngEF）去除O-聚糖，并结合唾液酸酶，以确保去糖基化效果。通过完整质量分析确认效果，并使用电子转移高能碰撞解离（EThcD）碎裂技术获取高质量肽段。同时，采用PEAKSAB分析其序列；在含18O环境下，利用PNGaseF酶解将糖基化Asn转化为Asp并标记18O，进行定量分析；以及用内切糖苷酶混合物处理样本，并通过质谱数据分析确认N-糖基化位点。

在这项研究中，研究团队设计了一种基于质谱的从头解码蛋白质糖基化的方法，利用含有唾液酸化的模型糖蛋白Fetuin-A进行了从头测序策略的开发。通过酶解糖苷键，简化了质谱分析，最终获得了去糖基化蛋白的一级序列。该方法的性能随后在依那西普中得到了验证，进一步揭示了三种未知TNFR:Fc融合生物制剂的氨基酸序列，探索了其与依那西普的相似性。

为确保N和O-糖基化的评估，采用了多层次的分析手段。通过PNGaseF催化的18O稳定同位素标记，分析出多个N-糖基化位点，并确认其与依那西普中已知位点的完美匹配。进一步的酶解实验则揭示了关键糖基化位点的修饰谱，确保了研究结果的有效性。

综上所述，基于质谱的蛋白质从头测序为揭示氨基酸序列提供了强有力的工具。例如，通过结合糖苷酶酶解和EThcD碎裂法提高了蛋白质测序的准确性和糖基化表征的完整性。这一新策略为深入研究高度糖基化蛋白质开辟了新途径，显示了该方法在生物制药领域的重要价值，尤其是在处理由尊龙凯时临床开发的生物药物时，其应用前景令人期待。